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Abbiamo usato un approccio cinetico steady-state in combinazione con la velocità di sedimentazione diretta gradiente studi di legame per Moncler Piumini 2014 esaminare la procedura dettagliata che sono coinvolti nel riconoscimento del DNA primer template e dNTP da quasi omogenea DNA umano polimerasi alpha. Abbiamo dimostrato che l'interazione della polimerasi con i suoi substrati obbedisce un meccanismo terreactant sequenziale rigidamente ordinata, con template come primo substrato, seguita da un fondo come secondo substrato e dNTP come terzo. Anche se il legame di fondo è prerequisito per la cineticamente significativo legame di dNTP, specificazione di quale dei quattro dNTP poi può aggiungere l'enzima è assolutamente determinata dalla sequenza di basi del modello (il primo substrato). L'elemento Piumini Moncler Prezzi critico nella dimostrazione del meccanismo ordinato è la dimostrazione del fenomeno di inibizione substrato indotta; la presenza di un primer dideossi-terminato (inibitore cieco) induce l'inibizione da substrato dNTP che è assolutamente limitata al dNTP complementare allo stampo in cui il primer viene bloccato ricotto. Questa inibizione è cineticamente com la dimostrazione del fenomeno di inibizione substrato indotta; la presenza di un primer dideossi-terminato (inibitore cieco) induce l'inibizione da substrato dNTP che è assolutamente limitata al dNTP complementare allo stampo in cui il primer viene bloccato ricotto. Questa inibizione è cineticamente com la dimostrazione del fenomeno di inibizione substrato indotta; la presenza di un primer dideossi-terminato (inibitore cieco) induce l'inibizione da substrato dNTP che è assolutamente limitata al dNTP complementare allo stampo in cui il primer viene bloccato ricotto. Questa inibizione è cineticamente competitivo con 3 '-hydroxyl-terminato (sbloccato) primer e si avvicina al 100% a saturare i livelli del dNTP complementare. Studi di legame diretto documentano l'abilità specifica ed esclusiva di dNTP complementari per guidare la polimerasi in un complesso stabile vicolo cieco con la struttura proposta, primer.dNTP enzyme.template.dideoxy, avvalorando così le osservazioni cinetici. I tentativi di chiarire l'ordine di rilascio del prodotto dalla enzima da studi di inibizione prodotto hanno dimostrato la reazione di polimerizzazione essere essenzialmente irreversibile ed hanno quindi avuto successo. Sulla base della processività noto di KB DNA polimerasi cellulare alpha, un modello preliminare che coinvolge versione iniziale di pirofosfato è ragionevole; Tuttavia, il rapporto tra il rilascio del prodotto e il processo di polimerasi traslocazione rimane oscuro. Tutti gli studi di legame cinetici e di sedimentazione sono stati eseguiti su una varietà di substrati DNA heteropolymeric omopolimerica e naturali, e la coerenza dei risultati stabilisce assolutamente l'identità qualitativa del meccanismo generale che umano alfa DNA polimerasi riconosce e replicato polydeoxynucleotide di primer-templates, indipendentemente dalla loro precisa natura fisico-chimiche.

 

 
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